我們經(jīng)常會(huì)用到轉(zhuǎn)染試劑來(lái)轉(zhuǎn)染一些細(xì)胞，那您知道一些具體的操作步驟嗎？下面將詳細(xì)為您講解具體的實(shí)驗(yàn)步驟。

  轉(zhuǎn)染前 ：

   首先，準(zhǔn)備細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所需試劑。細(xì)胞可以取實(shí)驗(yàn)室里已經(jīng)驗(yàn)證的易轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，如COS-1/Hela/CHO-K1細(xì)胞，同時(shí)實(shí)驗(yàn)前要重新復(fù)蘇一株低傳代細(xì)胞來(lái)確保該細(xì)胞株未被其他細(xì)胞和微**污染。選擇表達(dá)質(zhì)粒載體如β-gal載體，GFP載體等時(shí)，要先確保該質(zhì)粒能在所選的細(xì)胞系中表達(dá)良好。同時(shí)質(zhì)粒純化時(shí)要注意純化過(guò)程中勿使雙鏈斷裂以及無(wú)核酸酶和內(nèi)**污染。同時(shí)準(zhǔn)備新鮮的培養(yǎng)基，使用前用0.22um濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基來(lái)確保培養(yǎng)基無(wú)污染。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中勿加***，且需要不斷監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50-80%時(shí)，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.轉(zhuǎn)染中：

  首先，由于不同質(zhì)粒和脂質(zhì)體的較適合的搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前應(yīng)該做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索一個(gè)較合適的配比。作預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1:1、1:2、1:3、1:4的梯度來(lái)檢測(cè)比較合適的轉(zhuǎn)染比例，同時(shí)也需要設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)，如試劑對(duì)照：僅加入轉(zhuǎn)染試劑，可確定轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞**。DNA對(duì)照：僅加入DNA，確定制備DNA的質(zhì)量是否對(duì)細(xì)胞存在影響。空白對(duì)照：用空載體制備轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物（建議3：1的比例），確定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生理或功能的變化是源于目標(biāo)基因，還是源于轉(zhuǎn)染過(guò)程本身。 其次，在正式實(shí)驗(yàn)中，需要小心輕柔將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免大力吹打，使得脂質(zhì)體失效。

3.轉(zhuǎn)染后：

   首先，轉(zhuǎn)染24h后需要觀察轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞**情況，如果**比較高，可能是由以下原因造成的： *初期細(xì)胞接種濃度太低*轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入量過(guò)高，因?yàn)椴煌?xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染的敏感度不同*轉(zhuǎn)染后6小時(shí)需更換培養(yǎng)基，一是lipo2000具有一定**，二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。 其次，轉(zhuǎn)染后需要對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，比如觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況、qPCR驗(yàn)證或WB檢測(cè)敲減或者過(guò)表達(dá)蛋白。 *對(duì)于β-gal表達(dá)載體：可用β-gal染色***進(jìn)行細(xì)胞染色并觀察細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞在染色孵育后3-4h即可觀察到，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞則需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。 *對(duì)于GFP表達(dá)載體：熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。如果細(xì)胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達(dá)，表達(dá)太弱的細(xì)胞無(wú)法鏡檢。GFP表達(dá)情況也能使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可加入PI進(jìn)行染色以監(jiān)測(cè)死細(xì)胞情況。 **，若是轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以通過(guò)兩種方法增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。 （1）復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。 （2）通過(guò)*篩來(lái)殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞。前提是該質(zhì)粒帶有***抗性的基因。

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  看完這些，您是不是更加了解該如何進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)了呢？